Ffactorau ymyrraeth mewn adweithiau PCR

Yn ystod yr adwaith PCR, mae rhai ffactorau sy'n ymyrryd yn aml yn dod ar eu traws.
Oherwydd sensitifrwydd uchel iawn PCR, ystyrir bod halogiad yn un o'r ffactorau pwysicaf sy'n effeithio ar ganlyniadau PCR a gall gynhyrchu canlyniadau cadarnhaol ffug.
Yr un mor hanfodol yw'r amrywiol ffynonellau sy'n arwain at ganlyniadau ffug-negyddol. Os yw un neu fwy o rannau hanfodol o'r gymysgedd PCR neu'r adwaith ymhelaethu ei hun yn cael eu rhwystro neu eu hymyrraeth, gellir rhwystro'r assay diagnostig. Gall hyn arwain at lai o effeithlonrwydd a hyd yn oed canlyniadau negyddol ffug.
Yn ogystal â gwaharddiad, gall colli cyfanrwydd asid niwclëig targed ddigwydd oherwydd amodau cludo a/neu storio cyn paratoi sampl. Yn benodol, gall tymereddau uchel neu storfa annigonol arwain at ddifrodi celloedd ac asidau niwclëig. Mae gosod celloedd a meinwe ac ymgorffori paraffin yn achosion adnabyddus o ddarnio DNA a phroblem barhaus (gweler Ffigurau 1 a 2). Yn yr achosion hyn, ni fydd hyd yn oed ynysu a phuro gorau posibl yn helpu.

Ffigur 1 | Effaith ansymudiad ar gyfanrwydd DNA
Dangosodd electrofforesis gel agarose fod ansawdd y DNA wedi'i ynysu oddi wrth adrannau paraffin o awtopsïau yn amrywio'n sylweddol. Roedd DNA o wahanol hyd darnau cyfartalog yn bresennol yn y darnau yn dibynnu ar y dull gosod. Dim ond pan oedd yn sefydlog mewn samplau wedi'u rhewi brodorol ac mewn fformalin niwtral clustogi y cafodd DNA ei gadw. Arweiniodd y defnydd o atgyweiriwr bouin asidig cryf neu fformalin di-fwlch, sy'n cynnwys asid fformig, at golli DNA yn sylweddol. Mae'r ffracsiwn sy'n weddill yn dameidiog iawn.
Ar y chwith, mynegir hyd y darnau mewn parau cilobase (kbp)

Ffigur 2 | Colli uniondeb targedau asid niwclëig
(A) Bydd bwlch 3'-5 ′ ar y ddwy linyn yn arwain at seibiant yn y DNA targed. Bydd synthesis DNA yn dal i ddigwydd ar y darn bach. Fodd bynnag, os yw safle anelio primer ar goll ar y darn DNA, dim ond ymhelaethiad llinol sy'n digwydd. Yn yr achos mwyaf ffafriol, gall y darnau ail -addurno ei gilydd, ond bydd y cynnyrch yn fach ac yn is na lefelau canfod.
(B) Mae colli seiliau, yn bennaf oherwydd dad-draddodi a ffurfio pylu thymidine, yn arwain at ostyngiad yn nifer y bondiau H a gostyngiad yn TM. Yn ystod y cyfnod cynhesu hirgul, bydd y primers yn toddi i ffwrdd o'r DNA matrics ac ni fyddant yn anelio hyd yn oed o dan amodau llai llym.
(c) Mae seiliau thymin cyfagos yn ffurfio pylu TT.
Problem gyffredin arall sy'n aml yn digwydd mewn diagnosteg foleciwlaidd yw rhyddhau asidau niwclëig targed yn llai na optimaidd o'i gymharu ag echdynnu ffenol-clorofform. Mewn achosion eithafol, gall hyn fod yn gysylltiedig â negatifau ffug. Gellir arbed llawer o amser trwy ferwi lysis neu dreuliad ensymatig malurion celloedd, ond mae'r dull hwn yn aml yn arwain at sensitifrwydd PCR isel oherwydd rhyddhau asid niwclëig annigonol.

Gwahardd gweithgaredd polymeras wrth ymhelaethu

Yn gyffredinol, defnyddir gwaharddiad fel cysyniad cynhwysydd i ddisgrifio'r holl ffactorau sy'n arwain at ganlyniadau PCR is -optimaidd. Mewn ystyr biocemegol yn unig, mae ataliad wedi'i gyfyngu i weithgaredd yr ensym, hy, mae'n lleihau neu'n atal trosi cynnyrch swbstrad trwy ryngweithio â safle gweithredol y polymeras DNA neu ei gofactor (ee, mg2+ ar gyfer polymeras Taq DNA).
Gall cydrannau yn y sampl neu byfferau a darnau amrywiol sy'n cynnwys adweithyddion atal yr ensym yn uniongyrchol neu ddal ei gofactorau (ee EDTA), a thrwy hynny anactifadu'r polymeras ac yn ei dro gan arwain at ganlyniadau PCR negyddol llai neu ffug negyddol.
Fodd bynnag, mae llawer o ryngweithio rhwng cydrannau adweithio ac asidau niwclëig sy'n cynnwys targed hefyd yn cael eu dynodi fel 'atalyddion PCR'. Unwaith y bydd unigedd yn tarfu ar gyfanrwydd y gell a bod yr asid niwclëig yn cael ei ryddhau, gall rhyngweithio rhwng y sampl a'r toddiant o'i amgylch a'r cyfnod solet ddigwydd. Er enghraifft, gall 'scavengers' rwymo DNA un llinyn neu ddwbl trwy ryngweithio nad yw'n gofalent ac ymyrryd ag unigedd a phuro trwy leihau nifer y targedau sy'n cyrraedd y llong adweithio PCR yn y pen draw.
In general, PCR inhibitors are present in most body fluids and reagents used for clinical diagnostic tests (urea in urine, hemoglobin and heparin in blood), dietary supplements (organic components, glycogen, fat, Ca2+ ions) and components in the environment (phenols, heavy metals)

Gellir dod o hyd i atalyddion PCR mwy cyffredin mewn bacteria a chelloedd ewcaryotig, DNA nad ydynt yn darged, macromoleciwlau sy'n rhwymo DNA o fatricsau meinwe ac offer labordy fel menig a phlastigau. Puro asidau niwclëig yn ystod neu ar ôl echdynnu yw'r dull a ffefrir ar gyfer tynnu atalyddion PCR.
Heddiw, gall amrywiol offer echdynnu awtomataidd ddisodli llawer o brotocolau llaw, ond ni chyflawnwyd adferiad a/neu buro targedau 100% erioed. Efallai y bydd atalyddion posib yn dal i fod yn bresennol yn yr asidau niwclëig wedi'u puro neu gallant fod wedi dod i rym eisoes. Mae gwahanol strategaethau yn bodoli i leihau effaith atalyddion. Gall dewis y polymeras priodol gael effaith sylweddol ar weithgaredd atalydd. Dulliau profedig eraill i leihau ataliad PCR yw cynyddu crynodiad polymeras neu gymhwyso ychwanegion fel BSA.
Gellir dangos gwahardd adweithiau PCR trwy ddefnyddio Rheoli Ansawdd Proses Mewnol (IPC).
Rhaid cymryd gofal i gael gwared ar yr holl adweithyddion ac atebion eraill yn y pecyn echdynnu, megis ethanol, EDTA, CETAB, LICL, GUCKN, SDS, isopropanol a ffenol, o'r asid niwclëig sydd wedi'i ynysu gan gam golchi trylwyr. Yn dibynnu ar eu crynodiad, gallant actifadu neu atal PCR.