Ffactorau ymyrraeth mewn adweithiau PCR

Yn ystod yr adwaith PCR, deuir ar draws rhai ffactorau sy'n ymyrryd yn aml.
Oherwydd sensitifrwydd uchel iawn PCR, ystyrir bod halogiad yn un o'r ffactorau pwysicaf sy'n effeithio ar ganlyniadau PCR a gall gynhyrchu canlyniadau positif ffug.
Yr un mor hanfodol yw'r ffynonellau amrywiol sy'n arwain at ganlyniadau ffug-negyddol. Os caiff un neu fwy o rannau hanfodol o'r cymysgedd PCR neu'r adwaith ymhelaethu ei hun eu hatal neu eu ymyrryd, gellir rhwystro'r assay diagnostig. Gall hyn arwain at lai o effeithlonrwydd a hyd yn oed canlyniadau negyddol ffug.
Yn ogystal ag ataliad, efallai y bydd cyfanrwydd asid niwclëig targed yn cael ei golli oherwydd amodau cludo a/neu storio cyn paratoi sampl. Yn benodol, gall tymheredd uchel neu storio annigonol arwain at ddifrod i gelloedd ac asidau niwclëig. Mae sefydlogiad celloedd a meinwe ac ymgorffori paraffin yn achosion adnabyddus darnio DNA ac yn broblem barhaus (gweler Ffigurau 1 a 2). Yn yr achosion hyn, ni fydd hyd yn oed ynysu a phuro gorau posibl yn helpu.

Ffigur 1 | Effaith ansymudiad ar gyfanrwydd DNA
Dangosodd electrofforesis gel agarose fod ansawdd y DNA sydd wedi'i ynysu o rannau paraffin o awtopsïau yn amrywio'n sylweddol. Roedd DNA o wahanol hyd darnau cyfartalog yn bresennol yn y darnau yn dibynnu ar y dull gosod. Dim ond pan gafodd ei osod mewn samplau wedi'u rhewi brodorol ac mewn fformalin niwtral wedi'i glustogi y cafodd DNA ei gadw. Arweiniodd y defnydd o sefydlyn Bouin asidig iawn neu fformalin heb ei glustogi, yn cynnwys asid ffurfig, at golled sylweddol o DNA. Mae'r ffracsiwn sy'n weddill yn dameidiog iawn.
Ar y chwith, mynegir hyd y darnau mewn parau kilobase (kbp)

Ffigur 2 | Colli cyfanrwydd targedau asid niwclëig
(a) Bydd bwlch 3′-5′ ar y ddau edefyn yn arwain at doriad yn y DNA targed. bydd synthesis DNA yn dal i ddigwydd ar y darn bach. Fodd bynnag, os oes safle anelio paent preimio ar goll ar y darn DNA, dim ond mwyhad llinol sy'n digwydd. Yn yr achos mwyaf ffafriol, gall y darnau ailsefydlu ei gilydd, ond bydd y cynnyrch yn fach ac yn is na'r lefelau canfod.
(b) Mae colli basau, yn bennaf oherwydd depurination a ffurfio dimer thymidin, yn arwain at ostyngiad yn nifer y bondiau H a gostyngiad mewn Tm. Yn ystod y cyfnod cynhesu hir, bydd y paent preimio yn toddi i ffwrdd o'r DNA matrics ac ni fyddant yn anelio hyd yn oed o dan amodau llai llym.
(c) Mae basau thymin cyfagos yn ffurfio dimer TT.
Problem gyffredin arall sy'n digwydd yn aml mewn diagnosteg moleciwlaidd yw rhyddhau llai-na-optimaidd o asidau niwclëig targed o'i gymharu ag echdynnu ffenol-clorofform. Mewn achosion eithafol, gall hyn fod yn gysylltiedig â negyddol ffug. Gellir arbed llawer o amser trwy ferwi lysis neu dreulio ensymatig o falurion celloedd, ond mae'r dull hwn yn aml yn arwain at sensitifrwydd PCR isel oherwydd rhyddhau asid niwclëig annigonol.

Atal gweithgaredd polymeras yn ystod ymhelaethu

Yn gyffredinol, defnyddir ataliad fel cysyniad cynhwysydd i ddisgrifio'r holl ffactorau sy'n arwain at ganlyniadau PCR is-optimaidd. Mewn ystyr hollol biocemegol, mae ataliad wedi'i gyfyngu i weithgaredd yr ensym, hy, mae'n lleihau neu'n atal trosi cynnyrch swbstrad trwy ryngweithio â safle gweithredol y DNA polymeras neu ei cofactor (ee, Mg2 + ar gyfer Taq DNA polymerase).
Gall cydrannau yn y sampl neu wahanol glustogau a detholiadau sy'n cynnwys adweithyddion atal yr ensym yn uniongyrchol neu ddal ei gydffactorau (ee EDTA), a thrwy hynny anactifadu'r polymeras ac yn ei dro arwain at ganlyniadau PCR negyddol llai neu ffug.
Fodd bynnag, mae llawer o ryngweithiadau rhwng cydrannau adwaith ac asidau niwclëig sy'n cynnwys targed hefyd wedi'u dynodi'n 'atalyddion PCR'. Unwaith y bydd arwahanrwydd yn tarfu ar gyfanrwydd y gell a bod yr asid niwclëig yn cael ei ryddhau, gall rhyngweithiadau ddigwydd rhwng y sampl a'i hydoddiant o'i amgylch a'r cyfnod solet. Er enghraifft, gall 'scavengers' rwymo DNA sengl neu ddwbl trwy ryngweithiadau nad ydynt yn gofalent ac ymyrryd ag ynysu a phuro trwy leihau nifer y targedau sy'n cyrraedd y llestr adwaith PCR yn y pen draw.
Yn gyffredinol, mae atalyddion PCR yn bresennol yn y rhan fwyaf o hylifau'r corff ac adweithyddion a ddefnyddir ar gyfer profion diagnostig clinigol (wrea mewn wrin, hemoglobin a heparin yn y gwaed), atchwanegiadau dietegol (cydrannau organig, glycogen, braster, ïonau Ca2+) a chydrannau yn yr amgylchedd (ffenolau , metelau trwm)

Gellir dod o hyd i atalyddion PCR mwy cyffredin mewn bacteria a chelloedd ewcaryotig, DNA nad yw'n darged, macromoleciwlau matricsau meinwe sy'n rhwymo DNA ac offer labordy fel menig a phlastigau. Puro asidau niwclëig yn ystod neu ar ôl echdynnu yw'r dull a ffefrir ar gyfer cael gwared ar atalyddion PCR.
Heddiw, gall offer echdynnu awtomataidd amrywiol ddisodli llawer o brotocolau â llaw, ond ni chyflawnwyd adferiad a / neu buro targedau 100% erioed. Gall atalyddion posibl fod yn bresennol o hyd yn yr asidau niwclëig puredig neu efallai eu bod eisoes wedi dod i rym. Mae strategaethau gwahanol yn bodoli i leihau effaith atalyddion. Gall dewis y polymeras priodol gael effaith sylweddol ar weithgaredd atalydd. Dulliau profedig eraill i leihau ataliad PCR yw cynyddu crynodiad polymeras neu gymhwyso ychwanegion fel BSA.
Gellir dangos ataliad adweithiau PCR trwy ddefnyddio rheolaeth ansawdd prosesau mewnol (IPC).
Rhaid cymryd gofal i gael gwared ar yr holl adweithyddion a datrysiadau eraill yn y pecyn echdynnu, megis ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol a ffenol, o'r ynysu asid niwclëig trwy gam golchi trylwyr. Yn dibynnu ar eu crynodiad, gallant actifadu neu atal PCR.