Ffactorau ymyrraeth mewn adweithiau PCR

Yn ystod yr adwaith PCR, mae rhai ffactorau ymyrrol yn aml yn cael eu cyfarfod.
Oherwydd sensitifrwydd uchel iawn PCR, ystyrir bod halogiad yn un o'r ffactorau pwysicaf sy'n effeithio ar ganlyniadau PCR a gall gynhyrchu canlyniadau positif ffug.
Yr un mor bwysig yw'r amrywiol ffynonellau sy'n arwain at ganlyniadau negatif ffug. Os caiff un neu fwy o rannau hanfodol o'r cymysgedd PCR neu'r adwaith ymhelaethu ei hun eu hatal neu eu hymyrryd, gellir rhwystro'r assay diagnostig. Gall hyn arwain at effeithlonrwydd is a hyd yn oed ganlyniadau negatif ffug.
Yn ogystal ag ataliad, gall colli cyfanrwydd asid niwclëig targed ddigwydd oherwydd amodau cludo a/neu storio cyn paratoi sampl. Yn benodol, gall tymereddau uchel neu storio annigonol arwain at ddifrod i gelloedd ac asidau niwclëig. Mae sefydlogi celloedd a meinweoedd a mewnosod paraffin yn achosion adnabyddus o ddarnio DNA ac yn broblem barhaus (gweler Ffigurau 1 a 2). Yn yr achosion hyn, ni fydd hyd yn oed ynysu a phuro gorau posibl o gymorth.

Ffigur 1 | Effaith immobileiddio ar gyfanrwydd DNA
Dangosodd electrofforesis gel agarose fod ansawdd y DNA a ynyswyd o adrannau paraffin o awtopsïau yn amrywio'n sylweddol. Roedd DNA o wahanol hydau darn cyfartalog yn bresennol yn y darnau yn dibynnu ar y dull gosod. Dim ond pan gafodd ei osod mewn samplau wedi'u rhewi'n frodorol ac mewn formalin niwtral wedi'i glustogi y cadwyd DNA. Arweiniodd defnyddio gosodwr Bouin asidig cryf neu formalin heb glustogi sy'n cynnwys asid fformig at golled sylweddol o DNA. Mae'r ffracsiwn sy'n weddill wedi'i ddarnio'n fawr.
Ar y chwith, mynegir hyd y darnau mewn parau kilobas (kbp)

Ffigur 2 | Colli cyfanrwydd targedau asid niwclëig
(a) Bydd bwlch 3′-5′ ar y ddau linyn yn arwain at dorri yn y DNA targed. Bydd synthesis DNA yn dal i ddigwydd ar y darn bach. Fodd bynnag, os oes safle anelio primer ar goll ar y darn DNA, dim ond ymhelaethiad llinol sy'n digwydd. Yn yr achos mwyaf ffafriol, gall y darnau ail-ddirlawnu ei gilydd, ond bydd y cynnyrch yn fach ac yn is na'r lefelau canfod.
(b) Mae colli basau, yn bennaf oherwydd dadbwrineiddio a ffurfio dimer thymidin, yn arwain at ostyngiad yn nifer y bondiau H a gostyngiad yn Tm. Yn ystod y cyfnod cynhesu hirgul, bydd y primerau'n toddi i ffwrdd o'r DNA matrics ac ni fyddant yn anelio hyd yn oed o dan amodau llai llym.
(c) Mae basau thymine cyfagos yn ffurfio dimer TT.
Problem gyffredin arall sy'n digwydd yn aml mewn diagnosteg foleciwlaidd yw rhyddhau asidau niwclëig targed mewn ffordd llai na'r gorau posibl o'i gymharu ag echdynnu ffenol-clorofform. Mewn achosion eithafol, gall hyn fod yn gysylltiedig â chanlyniadau negatif ffug. Gellir arbed llawer o amser trwy lysis berwedig neu dreuliad ensymatig malurion celloedd, ond mae'r dull hwn yn aml yn arwain at sensitifrwydd PCR isel oherwydd rhyddhau asid niwclëig annigonol.

Atal gweithgaredd polymerase yn ystod ymhelaethiad

Yn gyffredinol, defnyddir ataliad fel cysyniad cynhwysydd i ddisgrifio'r holl ffactorau sy'n arwain at ganlyniadau PCR is-optimaidd. Mewn ystyr fiogemegol llym, mae ataliad wedi'i gyfyngu i weithgaredd yr ensym, h.y., mae'n lleihau neu'n atal trosi swbstrad-cynnyrch trwy ryngweithio â safle gweithredol y polymeras DNA neu ei gyd-ffactor (e.e., Mg2+ ar gyfer polymeras DNA Taq).
Gall cydrannau yn y sampl neu amrywiol fyfferau a dyfyniad sy'n cynnwys adweithyddion atal yr ensym yn uniongyrchol neu ddal ei gyd-ffactorau (e.e. EDTA), a thrwy hynny anactifadu'r polymeras ac yn ei dro arwain at ganlyniadau PCR is neu negyddol ffug.
Fodd bynnag, mae llawer o ryngweithiadau rhwng cydrannau adwaith ac asidau niwclëig sy'n cynnwys targedau hefyd wedi'u dynodi'n 'atalyddion PCR'. Unwaith y bydd cyfanrwydd y gell yn cael ei amharu trwy ynysu a bod yr asid niwclëig yn cael ei ryddhau, gall rhyngweithiadau rhwng y sampl a'i hydoddiant a'i chyfnod solet o'i gwmpas ddigwydd. Er enghraifft, gall 'sborion' rwymo DNA llinyn sengl neu ddwbl trwy ryngweithiadau anghofalent ac ymyrryd ag ynysu a phuro trwy leihau nifer y targedau sy'n cyrraedd llestr adwaith PCR yn y pen draw.
Yn gyffredinol, mae atalyddion PCR yn bresennol yn y rhan fwyaf o hylifau'r corff ac adweithyddion a ddefnyddir ar gyfer profion diagnostig clinigol (wrea mewn wrin, haemoglobin a heparin yn y gwaed), atchwanegiadau dietegol (cydrannau organig, glycogen, braster, ïonau Ca2+) a chydrannau yn yr amgylchedd (ffenolau, metelau trwm).

Gellir dod o hyd i atalyddion PCR mwy cyffredin mewn bacteria a chelloedd ewcariotig, DNA nad yw'n darged, macromoleciwlau sy'n rhwymo DNA mewn matricsau meinwe ac offer labordy fel menig a phlastigau. Puro asidau niwclëig yn ystod neu ar ôl echdynnu yw'r dull a ffefrir ar gyfer cael gwared ar atalyddion PCR.
Heddiw, gall amrywiol offer echdynnu awtomataidd ddisodli llawer o brotocolau â llaw, ond ni chyflawnwyd adferiad a/neu buro targedau 100%. Gall atalyddion posibl fod yn bresennol o hyd yn yr asidau niwclëig wedi'u puro neu efallai eu bod eisoes wedi dod i rym. Mae gwahanol strategaethau'n bodoli i leihau effaith atalyddion. Gall dewis y polymeras priodol gael effaith sylweddol ar weithgaredd atalydd. Dulliau profedig eraill i leihau ataliad PCR yw cynyddu crynodiad polymeras neu gymhwyso ychwanegion fel BSA.
Gellir dangos ataliad adweithiau PCR trwy ddefnyddio rheoli ansawdd proses fewnol (IPC).
Rhaid cymryd gofal i gael gwared ar yr holl adweithyddion a thoddiannau eraill yn y pecyn echdynnu, fel ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol a ffenol, o'r ynysydd asid niwclëig trwy gam golchi trylwyr. Yn dibynnu ar eu crynodiad, gallant actifadu neu atal PCR.